La cromatografía es una técnica de separación física de una sustancia desde una mezcla. La sustancia se encuentra disuelta en un medio fluido, la fase móvil, que se desplaza a través de una fase estacionaria. Las diferentes sustancias de la fase móvil tienen distinta afinidad por las sustancias que constituyen la fase estacionaria, por lo que cada sustancia se desplaza a distinta velocidad y causa su separación del resto de sustancias presentes en la mezcla.
Existen diferentes tipos de técnicas cromatográficas, por ejemplo la cromatografía de capa fina o la cromatografía de gases. La cromatografía de afinidad es un tipo de cromatografía que separa una sustancia de una mezcla utilizando interacciones moleculares altamente específicas pero reversibles, como son la interacción entre antígenos y anticuerpos, enzimas y sustratos o receptores y ligandos, por lo que es utilizada principalmente para separar macromoléculas biológicas.
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Descripción general
En la fase estacionaria se utiliza una molécula (ligando) que tenga alta afinidad y selectividad por la sustancia que se desea purificar (sustancia diana) y que esta presente en la fase móvil. A medida que la fase móvil avanza a través de la fase estacionaria, la sustancia a purificar irá interaccionando con la fase estacionaria quedando atrapada en ella y separada del resto de la mezcla.
La fase estacionaria suele ser un sólido, frecuentemente gel de agarosa, con el ligando insertando formando lo que se conoce como la resina de afinidad. La forma más habitual de realizar la cromatografía de afinidad en el laboratorio es el uso de columnas cromatográficas, unos tubos verticales en los que se introduce la resina de afinidad y por dónde se hace pasar la fase móvil.
La sustancia diana queda retenida en la resina de afinidad y el resto de sustancias pasan y se recogen al final de la columna. Posteriormente se lava la columna con una solución buffer que revierte la unión de la sustancia diana con el ligando.
Principales usos
La cromatografía de afinidad tiene numerosas aplicaciones, incluyendo purificación de ácidos nucleicos y purificación de proteínas desde extractos biológicos. También se utiliza para la purificación de anticuerpos en sueros sanguíneos (cromatografía de inmunoafinidad), hormonas y enzimas.
Uno de los usos más comunes de la cromatografía de afinidad es la purificación de proteínas recombinantes y la cromatogragía de afinidad por ión metálico inmovilizado, que aprovecha la interacción de algunos aminoácidos con metales para purificar proteínas, frecuentemente proteínas marcadas con esos aminoácidos mediante manipulación genética.
Otro tipo de cromatografía de afinidad muy común es la cromatografía con lecitinas. Algunas lecitinas, como la concanavalina A, pueden unirse de forma específica a determinados hidratos de carbono y esta característica se utiliza en cromatografía de afinidad para purificar y caracterizar glicoproteínas.